培養(yǎng)基的正確制備流程大揭秘

培養(yǎng)基的正確制備流程大揭秘

正確制備培養(yǎng)基時微生物檢驗的基礎(chǔ)步驟之一。使用脫水培養(yǎng)基和其他成分，尤其是含有有毒物質(zhì)(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應(yīng)遵守良好實驗室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說明。培養(yǎng)基的不正確制備會導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問題。

使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時，應(yīng)嚴格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關(guān)數(shù)據(jù)，如質(zhì)量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。

使用各別成分制備培養(yǎng)基時,應(yīng)按照配方準確配制,記錄所有細節(jié)信息,如;培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質(zhì)含量、制造商、批號、pH、培養(yǎng)基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。

1.水

除特定要求,實驗室用水的電導(dǎo)率在25℃下應(yīng)不高于25uS/cm(相當于電阻率≥0.4MΩcm)。

微生物污染應(yīng)不超過103CFU/mL，盡量低于102CFU/mL。應(yīng)根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的污染。

2.稱量和復(fù)水
稱量所需量的脫水培養(yǎng)基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊)后再加水至所需的量。
3.溶解和分裝
脫水培養(yǎng)基加水后適當加熱,并不攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱溶解前應(yīng)浸泡幾分鐘。
4.pH的測定和調(diào)整
用pH計測定pH,必要時在滅菌前調(diào)節(jié)pH，除特殊說明外,培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH。如果滅菌后調(diào)節(jié)pH，溶液需滅菌。
注:商品化培養(yǎng)基在高壓滅菌前后pH可能發(fā)生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調(diào)節(jié)pH。
5.分裝
將配置好的培養(yǎng)基分裝到適當?shù)娜萜髦?，容器的體積至少為體積的1.2倍。
6.滅菌
①概述
培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。
有些培養(yǎng)基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如，含亮綠的腸道菌培養(yǎng)基對光和熱特別敏感，應(yīng)在煮沸后快速冷卻，避光保存。同樣，一些試劑則不需要滅菌，直接使用(參見相關(guān)標準或生產(chǎn)廠商的使用說明）。
②濕熱滅菌
濕熱滅菌在高壓鍋或培養(yǎng)基制備器中進行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養(yǎng)基的體積超過1000mL，要對滅菌條件進行適當?shù)恼{(diào)整。所有操作均要按照標準和使用說明的規(guī)定進行。
注：大容量培養(yǎng)基（＞1000mL）滅菌時可能會造成過度加熱。
加熱后應(yīng)采取適當?shù)姆绞嚼鋮s，防止沸溢。這對大容量培養(yǎng)基和敏感性培養(yǎng)基（如含亮綠的培養(yǎng)基）是非常重要的。
③過濾滅菌
過濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進行。使用無菌設(shè)備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預(yù)消毒設(shè)備。
一些濾膜上附著蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)(如抗生素)。為達到有效過濾,應(yīng)事先將濾膜用無菌水潤濕。
④監(jiān)測
應(yīng)對經(jīng)濕熱或過濾滅菌的培養(yǎng)基進行監(jiān)測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進行監(jiān)測。
7.添加劑的制備

制備含有有毒物質(zhì)(特別是抗生素）時應(yīng)小心操作，避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發(fā)生其他不良反應(yīng)。采用適當?shù)念A(yù)防措施并小心按照產(chǎn)品使用說明操作。不要使用過期的試劑；抗生素工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用；批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存，但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應(yīng)提供冷凍對抗生素活性影響的相關(guān)資料，也可由使用者自行測定。

培養(yǎng)基的使用

1.瓊脂培養(yǎng)基的融化
將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養(yǎng)基融化后立即移開,室溫靜置片刻(約2min），以免玻璃容器發(fā)生破裂。
融化后的培養(yǎng)基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫，冷卻到47℃~50℃所需的時間取決于培養(yǎng)基的類型、體積和在水鍋里的分裝量。融化后內(nèi)培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時間一般不超過4h。剩余的培養(yǎng)基固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養(yǎng)基，應(yīng)根據(jù)相關(guān)標準，縮短融化后放置的時間。
將瓊脂培養(yǎng)基倒入類似檢測培養(yǎng)使用的獨立容器中,插入溫度計,記錄并保存瓊脂的融化溫度。
加入樣品的培養(yǎng)基應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)到44℃~47℃，或按照相關(guān)標準調(diào)節(jié)溫度。
2.培養(yǎng)基的脫氣
必要時，在使用前將養(yǎng)基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器蓋子；加熱后蓋緊蓋子，并迅速冷卻至使用溫度。
3.添加成分的加入
對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應(yīng)冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養(yǎng)基并充分混勻，盡快分裝到待用的容器中。
4.培養(yǎng)基的棄置
所有污染和未使用的培養(yǎng)基的棄置應(yīng)采用安全的方式,并符合相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。