新聞中心

我的位置:首頁  >  新聞中心  >  RT-qPCR實驗教您如何保證RNA的質(zhì)量

RT-qPCR實驗教您如何保證RNA的質(zhì)量

更新時間:2020-10-19      瀏覽次數(shù):451

RT-qPCR實驗教您如何保證RNA的質(zhì)量

 

在RT-qPCR實驗中,RNA提取完成后,需要對RNA的質(zhì)量進(jìn)行評估,合格后才可進(jìn)行后續(xù)實驗。評估方法有分光光度計,瓊脂糖凝膠電泳,Agilent 2100分析等,其中常用的有分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測。我們需要注意的是這兩種方法需要搭配使用,才能完成對RNA濃度、純度和完整度的檢測分析,以保證RNA的質(zhì)量。

分光光度計:

分光光度計主要用于測定RNA的濃度和純度,但不能對RNA的完整度和基因組殘留進(jìn)行檢測。其中,A260/280和A260/230是RNA純度檢測的重要參數(shù),可根據(jù)其數(shù)值的波動,檢測RNA的純度:
1、1.9< A260/280< 2.1,說明RNA純度較好;A260/280<1.9,表示RNA中可能有蛋白殘留;A260/280>2.1,表示RNA可能有部分降解,可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn)。
2、2.0< A260/230< 2.2,說明RNA純度較好;A260/230< 2.0,則說明RNA中可能有機試劑殘留,如酚、乙醇或糖類等。

瓊脂糖凝膠電泳:

瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分析RNA的完整度,基因組和蛋白殘留,但不能對RNA的濃度準(zhǔn)確定量,也不能檢測有機試劑的殘留。以真核生物RNA模板為例:
1、 將RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,若膠圖上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶,說明提取的RNA完整度良好。如果出現(xiàn)拖帶的現(xiàn)象,表示RNA部分降解。
2、若膠孔和28sRNA條帶之間出現(xiàn)單一明亮的條帶,表示可能有基因組DNA殘留。
3、若膠孔內(nèi)出現(xiàn)條帶,說明可能有蛋白等大分子物質(zhì)殘留。


逆轉(zhuǎn)錄
RNA提取完成后,需要反轉(zhuǎn)成cDNA才能進(jìn)行后續(xù)實驗,所以反轉(zhuǎn)步驟是*的。逆轉(zhuǎn)錄將從逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇和引物的選擇進(jìn)行介紹:

逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇:

常見代表性反轉(zhuǎn)錄酶有AMV RTase和MMLV RTase兩大類:AMV RTase的RNase H活性強,合成長度短,合成量低,熱穩(wěn)定性好(42~55℃);MMLV RTase的RNase H活性弱,合成長度長,合成量高,熱穩(wěn)定性差(37~42℃)。
由于RNase H酶具有降解RNA模板的功能,所以在逆轉(zhuǎn)錄時應(yīng)該優(yōu)先選擇RNase H活性弱的MMLV ,而且后期經(jīng)過基因工程改造,MMLV熱穩(wěn)定性已達(dá)到質(zhì)的飛躍。以Yeasen的Hifair Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶(11141)為例,該酶經(jīng)基因工程改造,刪除了RNase H活性,同時反應(yīng)溫度可達(dá)60℃,針對高GC及富含復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板具有更高的反轉(zhuǎn)錄效率。

引物的選擇:

通常RT primer可分為三類:oligo dT,隨機引物和基因特異性引物。根據(jù)不同的實驗需求選擇適合的引物進(jìn)行使用。

1、如果模板為真核生物來源,且后期cDNA用于常規(guī)PCR擴增,建議選擇Oligo(dT);若后續(xù)實驗僅用于qPCR,建議將Oligo(dT)與隨機引物混合后使用,可提高反轉(zhuǎn)錄效率。
2、如果模板為原核生物來源,反轉(zhuǎn)錄請選用Random Primers 或者基因特異性引物。

熒光定量

熒光定量主要從定量方法的選擇、引物設(shè)計原則、ROX的選擇、反應(yīng)體系的配置和反應(yīng)條件的設(shè)置等分別進(jìn)行闡述: 
 

定量方法的選擇:

定量方法分為相對定量和定量。相對定量可用于檢測某種處理方法對基因表達(dá)的影響,檢測基因在不同時間的表達(dá)差異和比較基因在不同組織中的表達(dá)差異;定量可對病毒中核酸的量進(jìn)行檢測等。大家在做實驗時,一定要根據(jù)自己的實驗選擇合適的定量方法。

  • 企業(yè)名稱:

    南京億迅生物科技有限公司

  • 聯(lián)系電話:

    025-65010873

  • 公司地址:

    江蘇省南京市江寧高新園

  • 企業(yè)郵箱:

    196099363@qq.com

掃碼關(guān)注我們

Copyright © 2024南京億迅生物科技有限公司 All Rights Reserved    備案號:蘇ICP備2020061857號-1

技術(shù)支持:環(huán)保在線    管理登錄    sitemap.xml

服務(wù)熱線

025-65010873

掃碼添加微信

返回頂部