總超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(NBT 核黃素微板法)的產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 總超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(NBT 核黃素微板法)的產(chǎn)品簡(jiǎn)介

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過(guò)氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基，壽命極短，SOD 活性一般用間接方法測(cè)定，并利用各種呈色反應(yīng)來(lái)測(cè)定 SOD 活力，其中顯色劑有 NBT(唑藍(lán)四氮)、WST-1、WST-8 等?？偝趸锲缁?SOD)檢測(cè)試劑盒(NBT 核黃素微板法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于 NBT 的光還原反應(yīng)，所以又稱作 NBT 光還原法，檢測(cè)原理是在有氧化物質(zhì)存在下核黃素被光還原，在有氧條件下，被還原的核黃素極易再氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2.-)，O2.-可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在 560nm處有強(qiáng)吸收，而 SOD 可清除超氧陰離子(O2.-)，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明 SOD 活性愈低，反之酶活性愈高，據(jù)此通過(guò)酶標(biāo)儀比色分析就可以計(jì)算出樣品中總超氧化物岐化酶活性水平。本方法是利用 SOD 抑制 NBT 在光照下的還原作用來(lái)確定酶活性大小，可用于檢測(cè)植物、組織、細(xì)胞、血清或其它樣品中 SOD 活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

自備材料：

1、生理鹽水或 PBS

2、電子天平、剪刀、低溫冰箱或制冰機(jī)、冰袋、勻漿器或研缽、離心機(jī)、離心管、小試管、 光照培養(yǎng)箱光源或 40W 熒光燈或日光燈、測(cè)光儀(照度計(jì))、酶標(biāo)儀、96 孔板

操作步驟(僅供參考)：

1、樣品處理：

①血漿或含紅細(xì)胞的樣品：從待測(cè)樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測(cè)，如超過(guò)檢測(cè)范圍，用 SOD 提取試劑稀釋后檢測(cè)；血清去除紅細(xì)胞的

簡(jiǎn)易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少 500μl 全血，4℃ 3000r/min 離

心 5min，轉(zhuǎn)移上清至另一新的 1ml 離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測(cè)，亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，如 ACK 紅細(xì)胞裂解液等。

②組織樣品：動(dòng)物用含有 20U/ml Heparin 的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml

Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品，按照每 100mg 組織加入 500μl SOD 提取試劑

的比例，用玻璃勻漿器在 4℃或冰浴勻漿，4℃ 4000r/min 離心 10min，取上清液(SOD

粗提液)用于酶活性的測(cè)定。

③細(xì)胞樣品：對(duì)于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測(cè)定，避免使用胰酶消化細(xì)胞，可以使用細(xì)胞刮或 EDTA 處理細(xì)胞并收集細(xì)胞，細(xì)胞用無(wú)菌的 PBS 或生理鹽水洗滌 1 次，按照每 106細(xì)胞加入 300~500μl SOD 提取試劑的比例，用玻璃勻漿器在 4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000r/min 離心 10min，取上清液(SOD 粗提液)用于酶活性的測(cè)定。

④植物樣品：準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g，剪碎，置于 4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中，加入預(yù)冷 SOD 提取試劑 1ml，低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，用 3ml

SOD 提取試劑沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管，加提取試劑至總體積為 4ml，4℃ 4000r/min 離心 20min，上清液為酶提取液，上清液可用于 SOD 的檢測(cè)。注意：如果

SOD 酶活性較低，應(yīng)相應(yīng)減少提取試劑的總體積，以便提高 SOD 酶的濃度。

⑤上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 法測(cè)定蛋白濃度，通常 10~20μg 蛋白的細(xì)胞或組織 勻漿液樣品其中的 SOD 平均活力約 1 個(gè)活力單位(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)；每種樣品準(zhǔn)備 20~100μg 蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測(cè)，根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用該試劑盒提供的 SOD 提取試劑適當(dāng)稀釋樣品，例如小鼠肝臟組織 10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為 10%)上清，通常需要稀釋 10~100 倍，準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測(cè)定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測(cè)定，可以-20℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測(cè)定。

2、(選做)準(zhǔn)備 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品：需自備 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的 SOD 提取試劑將 SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200、100、50、20、10、5、2U/ml，各取 20μl 參考樣品進(jìn)行檢測(cè)。注意：為避免稀釋后 SOD 酶活性的下降， SOD 標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用，本試劑盒對(duì)于 SOD 的檢測(cè)并不需要 SOD 作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可使用 SOD 標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照或作為對(duì) SOD 活性定量的參考。

3、選取合適的光源：在光照培養(yǎng)箱或日光燈下，用光度儀測(cè)定光度值為 3500~4000Lx 的

適合光照反應(yīng)的位置，做出標(biāo)記。

4、配制 NBT 工作液：將 Met 緩沖液與 NBT 溶液按 23:3 的比例混合即可。

5、SOD 加樣：參考下表使用 96 孔板設(shè)置空白對(duì)照孔、光照對(duì)照孔、測(cè)定孔，在低光強(qiáng)條件下按下表依次加入待測(cè)樣品和其它各種溶液，加入 FD 溶液后充分混勻。注意：加入

FD 溶液后反應(yīng)即會(huì)開(kāi)始，在低光強(qiáng)條件下用排槍操作可減小各孔間因加入試劑的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。

6、SOD 測(cè)定：混勻，取空白對(duì)照孔置于暗處，其他各孔置于 4000Lx 日光下反應(yīng) 20min，

各孔受光情況應(yīng)一致，溫度高時(shí)時(shí)間可縮短，低時(shí)延長(zhǎng)；反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定 560nm 處吸光度。

計(jì)算：

SOD 活力單位的定義：以抑制 NBT 光化還原的 50%為一個(gè)酶活性單位(U)。

液體中總 SOD 活力(U/ml)=(A 光照－A 測(cè)定)/(50%×A 光照×VT)

組織、細(xì)胞勻漿液中總 SOD 活力(U/g)=(A 光照－A 測(cè)定)×V/(50%×A 光照×VT×W)

血液中總 SOD 活力(U/gHb)=(A 光照－A 測(cè)定)×V×C/(50%×A 光照×VT×Hb)

式中：A 光照=光照對(duì)照孔的吸光度

A 測(cè)定=測(cè)定孔的吸光度

V=樣品液總體積(ml)

VT=測(cè)定時(shí)樣品所用體積(ml)

W=樣品鮮質(zhì)量(g)

C=1ml/采血量(ml)

Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)

注意事項(xiàng)：

1、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。待測(cè)樣品-70℃可保存 1 個(gè)月，需注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致 SOD 部分失活。

2、 植物中的多酚類物質(zhì)會(huì)引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取 SOD 酶時(shí)，必須添加多酚類物質(zhì)的吸附劑，將多酚物質(zhì)除去，避免酶蛋白變性失活。SOD 提取試

劑含有 PVP 等成分，可有效去除多酚類物質(zhì)。SOD 提取試劑不夠用可以用磷酸鈉緩沖液(0.05M,pH7.8)替代。

3、 細(xì)胞或組織等樣品制備時(shí)，不能采用含有 Triton X-100 等去垢劑的溶液，否則會(huì)干擾本試劑盒的檢測(cè)。

4、 抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，例如 0.1mM ascorbic acid，5mM GSH 都

會(huì)使測(cè)定出來(lái)的吸光度顯著升高。

5、 對(duì)于植物樣品，研磨處理應(yīng)迅速，以免 SOD 酶活下降，盡量在冰浴條件下處理。

6、 如果用分光光度計(jì)，比色杯光徑應(yīng)為 1cm，加入的上清及試劑量應(yīng)根據(jù)比色杯的最小

要求體積而定。

7、 所用離心管或 96 孔板應(yīng)潔凈透明，透光性好。

8、 一般要求各孔受光情況一致，所有反應(yīng)管應(yīng)排列在與日光燈燈管平行的直線上。

9、 反應(yīng)溫度控制在 25℃，視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間；溫度較高時(shí)，光照時(shí)間應(yīng)縮

短；溫度較低時(shí)，光照時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)。

10、 如果無(wú) 4000Lx 日光，可 200W 在 10~12cm 處，照射 20min；超凈工作臺(tái) 5cm 處光強(qiáng)約 800~1000Lx，,照射 30~40min；強(qiáng)太陽(yáng)光下一般光強(qiáng)可達(dá) 30000Lx，照射 5~15min，一般不建議直接用太陽(yáng)光。

11、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個(gè)月有效，4℃運(yùn)輸和保存。

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