植物過氧化物酶(POD)檢測(cè)試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的注意事項(xiàng)

 植物過氧化物酶(POD)檢測(cè)試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的注意事項(xiàng)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

過氧化物酶(peroxisome，POD)是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫，氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，該酶屬于細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。植物過氧化物酶(POD)檢測(cè)試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)檢測(cè)原理是以愈創(chuàng)木酚(又稱 2-甲氧基酚)作為底物，在酶促反應(yīng)的最適條件下采用每隔一定時(shí)間測(cè)定產(chǎn)物生成量的方法，于酶標(biāo)儀 470nm 處測(cè)定吸光度，以吸光度變化所需酶量進(jìn)行計(jì)算，主要用于植物組織的裂解液或勻漿液、血清等樣品中內(nèi)源性的過氧化物酶活性，尤其適用于測(cè)定水果中過氧化物酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。 

自備材料：

1、蒸餾水

2、研缽或勻漿器

3、離心管

4、低溫離心機(jī)

5、水浴鍋或恒溫箱

6、96 孔板、酶標(biāo)儀

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品：

①植物樣品：取 0.5-1.0g 植物組織或水果中層果肉加入 4ml 預(yù)冷的 POD Lysis Buffer

研磨或勻漿，4℃ 10000g 離心 15~20min，留取上清液，即為 POD 粗提液，-20℃凍

存，用于過氧化物酶的測(cè)定。

②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測(cè)定，-20℃凍存，用于過氧化物酶的測(cè)定。

③細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如有必要用 POD Lysis Buffer 進(jìn)行適當(dāng)勻漿，4℃ 10000g 離心 15~20min，留取上清液，即為 POD 粗提液，-20℃凍存，用于過氧化物酶的測(cè)定。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的過氧化物酶，可以使用 POD Lysis Buffer 進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、配制 POD Assay Buffer 工作液：取適量的 POD 氧化劑和 POD Assay Buffer，按 POD氧化劑：POD Assay Buffer=1：14 混合，即為 POD Assay Buffer 工作液，即配即用，不宜久置。

3、POD 加樣：取 96 孔板，按照下表設(shè)置對(duì)照孔孔、測(cè)定孔，注意：對(duì)照孔、測(cè)定孔中為同一待測(cè)樣品，但對(duì)照孔中是提前加熱煮沸 5min 的樣品；溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡，如果樣品中的 POD 活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置 2 平行孔，求平均值。

4、POD 測(cè)定：立即以酶標(biāo)儀，以對(duì)照孔為對(duì)照，測(cè)定 470nm 處測(cè)定孔的吸光度(A 測(cè)定 0)；

37℃準(zhǔn)確孵育 3min 后，立即加入 5μl POD 終止液終止反應(yīng)(備選方案)，以對(duì)照孔為對(duì)

照，以酶標(biāo)儀測(cè)定 470nm 處測(cè)定孔的吸光度(A 測(cè)定 1)。注意：加入 POD 終止液終止反

應(yīng)不是必須步驟，可 37℃準(zhǔn)確孵育 3min 后，以對(duì)照孔為對(duì)照，直接以酶標(biāo)儀測(cè)470nm 處測(cè)定孔的吸光度(A 測(cè)定 1)。

計(jì)算：

POD 活性單位的定義：在該實(shí)驗(yàn)條件下，每 1min 吸光度變化 0.01 所需酶量為一個(gè)活

性單位。

組織樣本 POD(U)={(A 測(cè)定 1-A 測(cè)定 0)×VT}/(W×VS×0.01×t)

式中：A 測(cè)定 1=孵育 3min 后測(cè)定孔的吸光度值

A 測(cè)定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后測(cè)定孔的吸光度值

W=組織樣本的重量(g)

VT=提取酶液的總體積(ml)

VS=測(cè)定時(shí)所用酶液體積(ml)

t=反應(yīng)時(shí)間

液體樣本 POD(U)=(A 測(cè)定 1-A 測(cè)定 0)/(0.01×t)

式中：A 測(cè)定 1=孵育 3min 后測(cè)定孔的吸光度值

A 測(cè)定 0=加入 POD Assay buffer 工作液后立即測(cè)定的測(cè)定孔吸光度值

t=反應(yīng)時(shí)間

注意事項(xiàng)：

1、 待測(cè)樣品中不能含有酶抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2、 POD 酶液提取時(shí)，注意低溫操作，防止酶活性。

3、 以煮沸的酶液為對(duì)照時(shí)，酶要充分失活。

4、 POD 氧化劑和 POD 終止液具有一定腐蝕性，請(qǐng)小心操作。

5、 POD 氧化劑易揮發(fā)，請(qǐng)密閉保存，否則檢測(cè)效率下降。

6、 如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定，每次檢測(cè)指標(biāo)不宜過多，否則操作時(shí)間不一，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。

7、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期：6 個(gè)月有效；常溫運(yùn)輸，4℃保存。

植物過氧化物酶(POD)檢測(cè)試劑盒(愈創(chuàng)木酚微板法)的注意事項(xiàng)