線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒

標題：線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒

產(chǎn)品概述

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒

測定原理

復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測定Pi增加速率來測定復(fù)合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1 mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前每支加入1.3mL雙蒸水，充分溶解備用，用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五：6mL×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL雙蒸水，充分混勻;

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL雙蒸水，充分混勻;

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL雙蒸水，充分混勻;

試劑九：液體10mL×1 瓶，室溫保存。

定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。

注意：配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

復(fù)合體Ⅴ的提取

• 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1.0 mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
• 4 ℃ 600 g離心5min。
• 將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心10min。
• 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。
• 在沉淀中加入800uL試劑二和8uL 試劑三，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。

測定步驟

1、酶促反應(yīng)

混勻， 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴30min

混勻，4000g，室溫離心10min，取上清液

2、定磷

混勻，室溫靜置10min左右，在 660nm處用對照管調(diào)零，讀取測定管吸光值

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒