手把手教您使用乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒

手把手教您使用乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒

測(cè)定意義： LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著 NAD+ /NADH 之間互變。測(cè)定原理： LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。需自備的儀器和用品：可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備： 1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 1000~5000：1 的比例（建議 2000 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。 

使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下： 1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線， y = 0.4554x+0.0037 (x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y 為 ΔA)。 2、血清（漿）LDH 活力的計(jì)算單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。 LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.4554÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037） 3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中 LDH 活力的計(jì)算（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。 LDH（nmol/min/mg prot）=（[ ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037） ÷Cpr 需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。（2） 按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。 LDH （ nmol/min/g 鮮 重 ） =[ （ ΔA-0.0037 ） ÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4× （ΔA-0.0037）÷W （3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。 LDH（nmol/min/104 cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073× （ΔA-0.0037）V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15 min； Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，2000 萬；103：1umol/mL=103 nmol/mL。 

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.1 umol/mL -2 umol/mL。 

2、 ΔA 線性范圍為：0.01 -1。