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PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽(yáng)性是什么原因造成的,你知道嗎
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。因此,無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液,只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,就能用PCR加以放大,進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法,意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年,PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1976年,中國(guó)科學(xué)家錢(qián)嘉韻,發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶,為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。
PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈,低溫(經(jīng)常是60°C左右)時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合,再調(diào)溫度至DNA聚合酶適合反應(yīng)溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?;诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備,能在變性溫度,復(fù)性溫度,延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。
引物設(shè)計(jì)的基本原則
1.引物長(zhǎng)度:15-30bp,常用為20bp左右。
2.引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。
3.引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。
4.引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%,引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能*互補(bǔ)序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
5.引物3‘端的堿基,特別是罪末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),選擇是G和C。
6.引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn),引入突變位點(diǎn),用生物素、熒光物質(zhì)、第高辛標(biāo)記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。
當(dāng)PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽(yáng)性是什么原因,如下:
1) 引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。
2) 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇?,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陽(yáng)性是什么原因造成的,你知道嗎
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