干擾物質(zhì)的用途，怎么使用

 干擾物是IVD診斷試劑檢測(cè)誤差的一個(gè)很重要的來(lái)源，它們?cè)谀撤N程度上對(duì)病人來(lái)說(shuō)表現(xiàn)為是一種危害。常規(guī)工作中精密度通過(guò)室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)控，準(zhǔn)確性通過(guò)與參考物質(zhì)作比較試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但實(shí)驗(yàn)室不能很容易的檢測(cè)干擾物質(zhì)引起的誤差。分析特異性是指被測(cè)物檢測(cè)結(jié)果不受其它成分干擾的能力，也就是說(shuō)，診斷試劑的檢測(cè)結(jié)果會(huì)因?yàn)橐恍┪镔|(zhì)的存在而受到影響，導(dǎo)致和實(shí)際情況有偏差。常見(jiàn)的干擾因素包括了溶血、血脂、膽紅素和生物素等。檢測(cè)方法已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于體外診斷試劑，但是任何免疫檢測(cè)方法都有可能受到干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果，其中內(nèi)源性干擾往往是由于試劑中使用的抗體與病人樣本中的內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)所致，這類干擾統(tǒng)稱為內(nèi)源性干擾。最易受到干擾的為基于雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法的免疫比濁、側(cè)向?qū)游觥⒒瘜W(xué)發(fā)光及，酶聯(lián)免疫方法等，此外，IgM檢測(cè)試劑亦會(huì)受到這類物質(zhì)的干擾。內(nèi)源性干擾物質(zhì)主要分為以下幾類：

A類風(fēng)濕因子 （Rheumatoidfactors，RF）

一、類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factor，RF)是一種抗人或動(dòng)物IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體。RF最初由Rose等(1984年)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清中發(fā)現(xiàn)。RA患者體內(nèi)有產(chǎn)生RF的B細(xì)胞克隆，在變性IgG或EB病毒的直接作用下可大量合成RF,RF主要為IgM類自身抗體，但也有IgG類、IgA類、IgD類和IgE類。

二、干擾引起假陽(yáng)性的原因：

雙抗體夾心法檢測(cè)系統(tǒng)中的捕獲抗體和信號(hào)抗體一般均為 IgG，當(dāng)樣本中的 RF 能同時(shí)與這兩種抗體Fc 段結(jié)合時(shí)，便會(huì)將捕獲抗體與信號(hào)抗體橋接，形成捕獲抗體-RF-信號(hào)抗體復(fù)合物，從而產(chǎn)生非特異性的檢測(cè)信號(hào)，造成檢測(cè)結(jié)果的假性增高或假陽(yáng)性，引起這種干擾的可能是 IgM-RF、IgG-RF 或者其他型別。人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的Fc段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。

RF對(duì)捕獲法干擾有兩種可能的機(jī)制，一種是由 IgM-RF 引起，由于第一步 IgM 的捕獲是非特異性的，IgM-RF 同樣被捕獲，被捕獲的 IgM-RF 最后與信號(hào)抗體( IgG 或 IgG 的抗原抗體復(fù)合物) 結(jié)合，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào); 另一種機(jī)制則與雙抗體夾心法類似，由 RF 直接將捕獲抗體和信號(hào)抗體橋接，同樣會(huì)引起假性增高或假陽(yáng)性。

三、輸入類風(fēng)濕因子干擾的排除

1.用F（ab)替代完整的IgG。

2.標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63°C，10min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）。

3.檢測(cè)抗原時(shí)，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。

B.異嗜性抗體(HA)

一、異嗜性抗體可以與許多動(dòng)物免疫球蛋白的fc和fab等部位上的表位結(jié)合，模擬被測(cè)抗原的免疫活性，同時(shí)結(jié)合捕獲抗體、標(biāo)記抗體干擾實(shí)驗(yàn)。異嗜性抗體對(duì)免疫球蛋白具有多特異性，但其親和力較弱。其免疫干擾的程度與頻率與自身的濃度、親和力及檢測(cè)系統(tǒng)等有關(guān)。

二、干擾引起假陽(yáng)性的原因：

夾心法免疫檢測(cè)至少使用兩種針對(duì)不同表位抗原的抗體，捕獲抗體在固相，標(biāo)記抗體游離在溶液中。正常情況下，樣本中的抗原與兩抗體結(jié)合，標(biāo)記抗體與固相結(jié)合的數(shù)量與樣本中的抗原濃度成正比（圖1）。異嗜性抗體在無(wú)抗原的情況下，也可以橋連這兩種抗體，因而增加結(jié)合標(biāo)記抗體的濃度（圖2），造成假陽(yáng)性結(jié)果。

最常見(jiàn)的抗體異嗜性抗體是HAMA（Human anti-mouse Antibodies），對(duì)臨床免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重大影響，HAMA 的免疫干擾主要表現(xiàn)在“兩步夾心法"為原理的免疫分析中可引起HAMA 橋聯(lián)介導(dǎo)的假陽(yáng)性或HAMA封閉抗體導(dǎo)致的假陰性的結(jié)果 。

三、干擾排除的方法

1.使用特異的抗體F(ab’)2片段作為固相或測(cè)定酶標(biāo)抗體。

2.在標(biāo)本或標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體。

3.使用特異的雞抗體IgG作為固相和測(cè)定抗體。雞IgG不與人抗鼠抗體反應(yīng)。因而，用其作為固相或酶標(biāo)抗體不會(huì)出現(xiàn)假增高或假降低結(jié)果。

C生物素（biotin）

一、生物素又被稱為維生素 B7或維生素H，是一種水溶性B族維生素。生物素的缺乏主要會(huì)損害皮膚、粘膜和神經(jīng)系統(tǒng)，在普通人群中長(zhǎng)期的生物素缺乏可能導(dǎo)致毛發(fā)、指甲、皮膚的損害。生物素-親合素系統(tǒng)是上世紀(jì)70年代末發(fā)展起來(lái)的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)?，F(xiàn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。生物素可與幾乎所有生物大分子結(jié)合，親和力高，結(jié)合穩(wěn)定，靈敏度高，具有多級(jí)放大作用。生物素干擾存在于使用生物素-親和素系統(tǒng)或生物素-抗生物素系統(tǒng)的檢測(cè)中。

二、干擾引起假陽(yáng)性的原因：

外源性生物素對(duì)基于 BAS 化學(xué)發(fā)光的干擾機(jī)制基于 BAS 的化學(xué)發(fā)光通過(guò)可被測(cè)量的光信號(hào)對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定?？杀粶y(cè)量的光信號(hào)由生物素標(biāo)記物 - 待測(cè)物質(zhì) - 發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記物 - 鏈霉親和素磁微粒復(fù)合物產(chǎn)生，該復(fù)合物的多少與光信號(hào)成正比。外源性生物素對(duì)基于 BAS 的化學(xué)發(fā)光干擾的機(jī)制是由于外源性生物素和試劑來(lái)源的生物素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的與鏈霉親和素磁微粒 (streptavidin-coated microparticles,M) 結(jié)合 ，當(dāng)外源性生物素達(dá)到一定量時(shí)，反應(yīng)體系中的生物素總量超過(guò)了鏈霉親和素磁微粒的結(jié)合能力，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)被捕獲減少，光信號(hào)減弱，從而引起干擾。

三、干擾排除的方法

1.增加鏈霉親和素含量或者鏈霉親和素預(yù)處理樣本。

2.使用D-生物素抗體替代鏈霉素親和素或使用生物素阻斷劑。

D血紅蛋白

溶血（Hemolysis） 紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白逸出稱紅細(xì)胞溶解，簡(jiǎn)稱溶血。可由多種理化因素和毒素引起。在體外，如低滲溶液、機(jī)械性強(qiáng)力振蕩、突然低溫冷凍（-20℃～－25℃）或突然化凍、過(guò)酸或過(guò)堿，以及酒精、乙醚、皂堿、膽堿鹽等均可引起溶血。

標(biāo)本溶血時(shí)可釋放出大量具有過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，干擾測(cè)定結(jié)果。

解決方法

標(biāo)本采集和處理時(shí)必須注意避免溶血。

E脂血

脂血是最常見(jiàn)的干擾之一，高脂血標(biāo)本之所以對(duì)檢驗(yàn)產(chǎn)生干擾，主要是因?yàn)橹械娜槊宇w粒會(huì)引起脂濁現(xiàn)象的產(chǎn)生，而脂濁是一種懸浮顆粒，易導(dǎo)致光線的散射，使標(biāo)本看起來(lái)十分渾濁。會(huì)對(duì)生化檢測(cè)的結(jié)果產(chǎn)生一定程度的影響。

解決辦法

1.采用高速離心的方法，取其下層清液進(jìn)行測(cè)定。

2.取樣本上層清液放置在冰箱中進(jìn)行保存，冰箱靜置一天后取出進(jìn)行測(cè)定

3.對(duì)樣品用生理鹽水稀釋，當(dāng)測(cè)定結(jié)果出來(lái)后再乘以稀釋倍數(shù)。

F膽紅素

膽紅素是膽色素的一種，是人膽汁中的主要色素，呈橙黃色。它是體內(nèi)鐵卟啉化合物的主要代謝產(chǎn)物，有毒性，可對(duì)大腦和神經(jīng)系統(tǒng)引起不可逆的損害，但也有抗氧化劑功能，可以抑制亞油酸和磷脂的氧化。膽紅素、烯醇化的膽紅素和膽綠素三者的光吸收幾乎覆蓋300-900nm之間的波長(zhǎng)范圍，在上述波長(zhǎng)內(nèi)膽紅素的存在會(huì)引起本底吸光度升高，造成本底干擾會(huì)對(duì)其他一些項(xiàng)目的檢測(cè)造成影響。